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不同品种枇杷果实酚类物质及其抗氧化活性解析

酚类物质是植物重要的次生代谢产物之一,广泛存在于植物中,影响植物的品质,由于酚类物质结构中携有一个或多个羟基,对自由基有良好的清除能力,表现出很强的抗氧化活性,因而植物酚类物质及抗氧化活性研究成为近年农业科研领域的热点,在枇杷叶、花、核、果已有相关报道。研究表酚类具体的组成及各成分含量与抗氧化能力有很高的相关性,在枇杷花、叶中也得到相同结果,枇杷果实中酚类的组成研究较少,仅张文娜、徐红霞等研究了浙江10 个品种的枇杷果实酚类物质组成,其他品种尚未见报道。福建是枇杷的主产区之一,2013 年年产量达23.7 万吨,主栽的品种有红肉系的早钟6 号、长红3 号、解放钟和白肉系的白梨等,本实验以这4种枇杷果实为试材,采用超声波辅助乙醇提取法提取其中的酚类物质,用DPPH 法( DPPH 自由基清除法) 和FRAP 法( 铁还原比色法) 来评价其抗氧化能力,并使用高效液相色谱法分析酚类组成,研究不同品种果实酚类组成与抗氧化性关系,并与已研究较多的宁海白比较,以期为枇杷深加工提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

5 种枇杷果实莆田市果树研究所提供,按成熟时间分为早熟的早钟6 号,中熟的长红3 号和宁海白,中晚熟的白梨及晚熟的解放钟,果实于正常食用成熟度采收,当天运至实验室,选取成熟度一致、无虫害、无明显损伤、果实饱满的枇杷置于-70 ℃超低温冰箱冷冻保存待用; 表儿茶酸、鞣花酸、咖啡酸、阿魏酸、绿原酸美国Sigma 公司; 新绿原酸、隐绿原酸、TPTZ( 2,4,6-反式2-吡啶基三嗪) 、DPPH( 1,1- 二苯基-2- 三硝基苯肼) 上海源叶生物科技有限公司; 甲醇、乙腈色谱纯,国药集团化学试剂有限公司; 其他试剂分析纯; 实验用水超纯水。Agilent 1100 高效液相色谱仪美国Agilent 公司采用紫外检测器ZORBAXSB-C18色谱柱( 150 mm 4.6 mm,5 722- 型可见分光光度计上海光谱仪器有限公司; KQ-100DE 型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司; KDC-40 低速离心机安徽中科中佳科学仪器有限公司; Ultra pure 超纯水机上海和泰仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 枇杷果实酚类物质提取果实从冰箱取出去皮去核后,果肉迅速切成碎末,准确称取10.000 g,加入30 mL 70%乙醇溶液,浸泡1 h,超声提取20 min( 温度30 ℃,功率200 W) ,再以5000 g 的转速离心20 min,减压抽滤得到滤液,滤液用70% 乙醇定容至50 mL,即为枇杷果实提取液,用于测定DPPH的清除能力和铁离子还原能力及浓缩后用于酚类物质分析。

1.2.2 总酚含量测定采用Folin-Ciocaileu 比色法测多酚含量,取1 mL 提取液加入20 mL 水,2.5 mLFoLin-CiocaLteu 试剂,反应5 min 后加入2.5 mL 饱和碳酸钠溶液,最后加水定容至50 mL 静置2 h,于765 nm 波长处测定其吸光度。以没食子酸( GAE) 为标样绘制标准曲线,根据标准曲线计算样品中总酚含量,结果以样品中含有的没食子酸当量( g /g FW)表示。

1.2.3 提取液枇杷果实抗氧化能力的测试

1.2.3.1 清除DPPH能力的测定参照文献加以修改,DPPH 乙醇溶液浓度为2.13 10 - 4 mol /L,取等体积的DPPH 溶液和枇杷提取液混合,室温避光反应30 min 后于517 nm 波长处测定其吸光度( Ai) ; 等体积的DPPH 溶液和乙醇混合,测溶液的吸光值( A0) ; 等体积的提取液和乙醇混合,测溶液的吸光值( Aj) 。记录A0,Ai和Aj,按下列公式计算清除率IP:IP( %) =[1-( Ai-Aj) /A0] 100。

1.2.3.2 铁离子还原力测定参照文献方法测试提取液FRAP 值。取1 mL 提取液,稀释至25 mL。取该稀释液1 mL,加入2.7 mL FRAP 工作液( 20 mmol /L三氯化铁溶液、300 mmol /L 醋酸盐缓冲液、10 mmol /LTPTZ 溶液按1∶ 10∶ 1配制) ,加入6 mL 水,37 ℃下反应10 min 后测定593 nm 处的吸光度。以硫酸亚铁铵溶液为标样绘制标准曲线,以达到相同吸光度所需硫酸亚铁的量来计算样品FRAP 值,单位为mmol /L。

1.2.4 枇杷果实提取液的HPLC 分析1.2.4.1 HPLC 检测条件色谱柱: Kromasil C18( 150 mm 4.6 mm) ; 进样量: 20 流速: 0.8 mL/min;柱温: 30 ℃; 检测波长: 280 nm; 流动相A: 5%乙酸水溶液; 流动相B: 100% 乙腈。梯度洗脱程序: 0 ~25 min时A 从90% 降至70%,25 ~ 35 min 时A 从70%升回至90%。

1.2.4.2 酚单体的HPLC 分析分别准确称取7 种酚单体对照品,用色谱纯的甲醇溶解,配制成0.1 mg /mL的溶液,测定其保留时间。再配制各酚单体浓度为0.1 mg /mL 的混合对照品溶液并逐级稀释,测定峰面积,计算得到浓度与峰面积的回归方程,溶液测试前过0.45 m 的滤膜。

1.2.4.3 样品的处理与分析取25 mL 的提取液减压蒸馏除去乙醇,再用正己烷萃取3 次,通过减压蒸馏除去正己烷后,用甲醇定容到5 mL,用于HPLC 分析,溶液测试前过0.45 m 的滤膜,采用外标法计算含量。

1.3 综合抗氧化能力指数( APC) 的计算

参照文献计算综合抗氧化能力指数( APC)来进行提取液中酚类物质抗氧化活性的总体比较:APC 指数= [每种方法测定值/ ( 每种方法测定最大值 测试方法总数) ]。

1.4 数据分析

所有测定重复3 次,运用Origin 8.5 软件进行数据作图,运用SPSS 20 软件进行数据分析: 单因素显著性分析( One-way analysis of variance,ANOVA) ,皮尔森相关性分析( Pearsons correlation analysis) 。所得结果采用平均数据 标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 不同品种枇杷果实总酚含量与抗氧化活性分析

没食子酸线性回归方程为y = 0.0078x + 0.0026,R2 = 0.9986,线性范围: 4.10~28.67 mg /L。对照回归方程可得5 个品种枇杷果实的总酚含量介于327.31~615.22 g /g 之间( 见表1) ,高低顺序为解放钟早钟6 号宁海白白梨长红3 号,其中宁海白的总酚含量与冯健君的报道吻合,比徐红霞的结果低,可能是由生长环境及成熟度不同引起。早钟6 号与解放钟果实的总酚含量接近于长红3 号与白梨含量的2 倍,组间差异达到显著水平。由表2 可知道,5个品种枇杷果实提取液均有抗氧化活性,其中DPPH 法显示清除能力排序为宁海白早钟6 号长红3 号解放钟白梨,早钟6 号与解放钟、白梨的差异达到显著水平; FRAP 法( 回归方程为y = 0.9686x-0.0333,R2= 0.9982,线性范围: 0.2 ~ 2.0 mmol /L测定的结果显示各品种抗氧化能力排序为宁海白早钟6 号解放钟长红3 号白梨。DPPH 法主要评价物质的清除自由基能力,FRAP 法评价物质的还原能力,测试方法不同,响应物不同,2种评价结果不完全一致说明反应底物可能有区别,可进一步分析其组成。综合抗氧化能力指数APC 显示福建产的红肉系的早钟6 号、解放钟、长红3 号总抗氧化活性高于白肉系的白梨,早钟6 号正是福建主栽的枇杷品种,抗氧化能力较高说明其在营养保健方面有一定优势。

2.2 不同品种枇杷果实酚类物质组成分析

2.2.1 不同品种枇杷果实的酚类物质组成定性定量分析参考文献报道,通过对比对照品、样品及加标样品的保留时间,用HPLC 法共鉴定出7 种酚类物质,按出峰时间排序为: 新绿原酸,绿原酸,隐绿原酸,表儿茶素,咖啡酸,鞣花酸,阿魏酸。各酚含量总体上为绿原酸 新绿原酸 隐绿原酸 表儿茶素 阿魏酸 咖啡酸 鞣花酸,绿原酸含量明显高于其他酚类物质,与报道相符,且其在5 个品种中的含量差异达到显著水平,其中宁海白中最高,早钟6 号次之; 新绿原酸和隐绿原酸的含量大小顺序均为宁海白早钟6 号长红3号解放钟白梨 表儿茶素、咖啡酸、鞣花酸和阿魏酸的含量较低,大小顺序随品种变化较大。整体上看宁海白和早钟6 号的各种酚单体含量均比较高,白梨最低; 长红3 号与解放钟中的新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、表儿茶素等的含量差异均达到显著水平,但总含量相近,这与其总抗氧化能力大小相符。

2.2.2 枇杷果实抗氧化物质组成与抗氧化能力相关性分析从表3 可见,总酚含量及HPLC 法测定的总含量与DPPH 清除能力、FRAP 值都呈正相关关系,其中与总酚含量DPPH 的相关性到达显著水平,但酚单体与抗氧化能力DPPH、FRAP 的关系不尽相同。其中新绿原酸、绿原酸含量与DPPH 呈显著的正相关( r 分别为0.941、0.887,p 均小于0.05) ,与FRAP 存在正相关。隐绿原酸含量与DPPH 存在极显著的线性正相关关系( r = 0.963,p 小于0.01) ,与FRAP 存在正相关但相关性不显著。表儿茶素含量与DPPH、FRAP; 咖啡酸含量与DPPH、FRAP; 鞣花酸含量与DPPH 均呈中等强度相关但影响效果不显著。其它酚单体与抗氧化能力的相关性较弱,可能是因为含量较低或者本身抗氧化能力比较弱。

3 结论

运用2 种方法来评价枇杷果实抗氧化能力,结果表明宁海白的抗氧化能力最高,白梨的抗氧化能力最低。福建产的枇杷抗氧化能力为: 红肉枇杷果实 白肉枇杷果实,早钟6 号最高。HPLC 检测表明在5 种枇杷果实中均存在7 种酚类物质,分别是新绿原酸,绿原酸,隐绿原酸,表儿茶素,咖啡酸,鞣花酸,阿魏酸。绿原酸含量最高,其次是新绿原酸、隐绿原酸,这三种酚含量与抗氧化能力显著正相关,是主要的抗氧化性活性酚类物质。